二代測序
二代測序簡介
【添加時間：2016-07-21 16:53:59】【來源：】【作者：dggadmin】
第二代測序技術(shù)是基于大規(guī)模平行測序的DNA測序技術(shù)。 其核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。
1）測序文庫的構(gòu)建
首先準備基因組，然后將DNA隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭。如果是轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小對于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insert size，以便在組裝的時候獲得更多的信息。
2）錨定橋接
Solexa測序的反應(yīng)在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell又被細分成8個Lane，每個Lane的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增使用。
3）預(yù)擴增
添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
4）單堿基延伸測序
在測序的flow cell中加入四種熒光標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。
5）數(shù)據(jù)分析
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度只有幾十個堿基的序列，要通過生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，并進一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。
圖1：Illumina 測序儀
Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。其操作流程如下：1）測序文庫的構(gòu)建
首先準備基因組，然后將DNA隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭。如果是轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小對于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insert size，以便在組裝的時候獲得更多的信息。
2）錨定橋接
Solexa測序的反應(yīng)在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell又被細分成8個Lane，每個Lane的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增使用。
3）預(yù)擴增
添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
4）單堿基延伸測序
在測序的flow cell中加入四種熒光標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。
5）數(shù)據(jù)分析
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度只有幾十個堿基的序列，要通過生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，并進一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。
